Гемоглобин и различные методы его измерения

Методы измерения гемоглобина (Hb) были впервые разработаны еще более ста лет назад, так что гемоглобин был одним из первых диагностических анализов крови, доступных клиницистам в первые десятилетия 20-го века, когда лабораторная медицина находилась в зачаточном состоянии.

Сегодня это наиболее часто запрашиваемый анализ крови и он проводится не только в больничной лаборатории, но и в различных медицинских учреждениях, рядом медицинских работников, использующих технологии различной сложности.

Например, в условиях интенсивной терапии и неотложной помощи гемоглобин измеряется персоналом медсестер с использованием технологий, встроенных в анализаторы газов крови.

В центре внимания этой статьи являются методы, используемые в настоящее время для измерения концентрации гемоглобина в крови (c tHb) как в лаборатории, так и за ее пределами, но она начинается с краткого рассмотрения структуры и функции гемоглобина и клинической пользы измерения.

Нормальная функция клетки зависит от непрерывной подачи в нее кислорода. Поскольку кислород потребляется во время метаболизма клеток, образуется двуокись углерода.

Принципиальной функцией крови является доставка кислорода (O2), присутствующего во вдыхаемом воздухе, из легких в каждую клетку в организме и доставку углекислого газа (CO2) из клеток в легкие, для удаления из организма во внешний воздух.

Эти жизненно важные функции транспорта газа зависят от белкового гемоглобина, содержащегося в эритроцитах. Каждый из 5 10*10 эритроцитов, обычно присутствующих в 1 мл крови, содержит около 280 миллионов молекул гемоглобина.

Структура и функция гемоглобина.

Молекула гемоглобина (Hb) примерно сферическая и содержит две пары разнородных субъединиц.

Каждая из субъединиц представляет собой сложенную полипептидную цепь (часть глобина) с присоединенной группой гема (полученной из порфирина).

В центре каждой группы гема находится единственный атом железа в состоянии железа (Fe 2+ ). Таким образом, гем является металлопорфирином, который, кстати, ответственен за красный цвет крови.

Кислородсвязывающая часть Hb представляет собой своеобразный карман гема, присутствующий в каждой из четырех полипептидных цепей; один атом кислорода образует обратимую связь с железом в каждом из этих участков, поэтому молекула Hb связывает четыре молекулы кислорода; продукт представляет собой оксигемоглобин (O2Hb).

Гемоглобин в кровиФункция доставки кислорода гемоглобином, то есть его способность «присоединять» кислород в легких и «высвобождать» его в тканевые клетки, стала возможной благодаря небольшим конформационным изменениям в четвертичной структуре, которые происходят в молекуле гемоглобина и которые изменяют сродство гема-карман для кислорода. Hb имеет два четвертичных структурных состояния: «дезокси-состояние» (с низким сродством к кислороду) и кислородное состояние (с высоким сродством к кислороду).

Ряд факторов окружающей среды определяет четвертичное состояние Hb и, следовательно, его относительное кислородное сродство. Микроокружение в легких благоприятствует окси-четвертичному состоянию, и, следовательно, Hb имеет высокое сродство к кислороду здесь.

Напротив, микроокружение тканей индуцирует конформационное изменение структуры Hb, которое уменьшает его сродство к кислороду, что позволяет высвобождать кислород в тканевые клетки.

Удаление диоксида углерода.

Небольшое количество (до 20%) СО 2 переносится из тканей в легкие, слабо связанные с N-концевой аминокислотой четырех гемоглобиновых единиц гемоглобина; продуктом этой комбинации является карбаминогемоглобин (карбоксигемоглобин). Однако большинство CO 2 транспортируется в виде бикарбоната в плазме крови.

Эритроцитарная конверсия СО 2 в бикарбонат, необходимый для этого режима переноса СО 2 , приводит к получению ионов водорода (Н + ). Эти водородные ионы забуферированы дезоксигенированным гемоглобином.

В капиллярной крови, протекающей через ткани, кислород высвобождается из гемоглобина и переходит в тканевые клетки. Углекислый газ диффундирует из тканевых клеток в эритроциты, где карбоксиангидраза ферментов в красной клетке позволяет ее реакции с водой образовывать углекислоту.

Углекислота диссоциирует до бикарбоната (который переходит в плазму крови) и ионов водорода, которые сочетаются с ныне дезоксигенированным гемоглобином. Кровь течет в легкие, а в капиллярах альвеол легких вышеуказанные пути меняются на противоположные. Бикарбонат входит в эритроциты и здесь объединяется с ионами водорода, высвобождаемыми из гемоглобина, с образованием угольной кислоты.

Это диссоциирует с диоксидом углерода и водой. Углекислый газ диффундирует из крови в альвеолы легких и устраняется в выдыхаемом воздухе. Между тем, кислород диффундирует из альвеол в капиллярную кровь и сочетается с гемоглобином.

Патологический гемоглобин, который не может присоединять и транспортировать кислород.

Хотя обычно присутствуют только в следовых количествах, существует три вида гемоглобина: метгемоглобин (MetHb или Hi), сульфгемоглобин (SHb) и карбоксигемоглобин (COHb), которые не могут связывать кислород.

Таким образом, они функционально несостоятельны и увеличение количества любого из этих видов гемоглобина, как правило, является результатом воздействия конкретных лекарств или токсинов окружающей среды, может серьезно подорвать доставку кислорода.

В общем анализе крови (c tHb), общую концентрацию гемоглобина обычно определяют как сумму оксигенированного гемоглобина, дезоксигенированного гемоглобина, карбоксигемоглобина и метгемоглобина.

Анемия.

Основной причиной измерения общего анализа крови c tHb является выявление анемии и оценка ее тяжести.

Анемия может быть определена как уменьшение кислородонесущей способности крови за счет сокращения числа эритроцитов. Чем ниже гемоглобин c tHb, тем тяжелее анемия.

Анемия не является заболеванием, а скорее следствием или признаком болезни. Причина, почему ctHb — такой часто запрашиваемый анализ крови, заключается в том, что анемия является признаком целого ряда патологий, многие из которых относительно распространены.

Общие симптомы анемии, большинство из которых неспецифичны, включают: бледность, усталость и сонливость, одышка — особенно при нагрузке, головокружение и обморок, головные боли, запоры и повышенная частота пульса.

Полицитемия.

В то время как анемия характеризуется уменьшением ctHb, повышенная ctHb указывает на полицитемию. Полицитемия возникает как ответ на любое физиологическое или патологическое состояние, при котором кровь содержит меньше кислорода, чем обычно (гипоксемия).

Реакция организма на гипоксемию включает увеличение производства эритроцитов для увеличения доставки кислорода и, как следствие, повышение ctHb. Эта так называемая вторичная полицитемия является частью физиологической адаптации к большой высоте и может быть признаком хронической неспецифической болезни легких.

Первичная полицитемия является гораздо менее распространенным злокачественным заболеванием костного мозга, которое характеризуется неконтролируемым образованием всех клеток крови, включая эритроциты. Полицитемия, как вторичная, так и первичная, обычно гораздо менее распространена, чем анемия.

Измерение c tHb.

Первый клинический тест на измерение Hb, разработанный более века назад, включал добавление капель дистиллированной воды к измеряемому объему крови до тех пор, пока ее цвет не соответствовал искусственному цветному стандарту.

Более поздняя модификация включала в себя первую насыщаемую кровь углекислым газом (окисью углерода) для преобразования гемоглобина в более стабильный карбоксигемоглобин. Современная гемоглобинометрия датируется 50-ми годами двадцатого века после развития спектрофотометрии и метода гемоглобинцинида (цианаметгемоглобина).

Последовала адаптация этого метода и других для использования в автоматизированных гематологических анализаторах. За последние два десятилетия успехи были сосредоточены на разработке методов, которые позволяют проводить тестирование на предмет оказания неотложной помощи.

В этом разделе сначала рассматриваются некоторые из методов, используемых в настоящее время в лабораториях, а затем с использованием тех методов POCT, которые используются вне лаборатории.

Спектрофотометрический метод.

Спустя почти 40 лет после того как он был впервые принят в качестве эталонного метода для измерения гемоглобина Международным комитетом по стандартизации в гематологии (ICSH), тест гемиглобинцианида (HiCN) остается рекомендуемым методом ICSH, против которого все новые методы c tHb оцениваются и стандартизируются.

Приведенное подробное рассмотрение отражает его постоянное значение как в качестве эталонного, так и рутинного лабораторного метода.

Принцип испытания.

Кровь разбавляют в растворе, содержащем феррицианид калия и цианид калия. Феррицианид калия окисляет железо в геме в состояние трехвалентного железа с образованием метгемоглобина, который превращается в гемиглобинцианид (HiCN) цианидом калия.

HiCN — это стабильный цветной продукт, который в растворе имеет максимум поглощения при 540 нм и строго подчиняется закону Бир-Ламберта. Абсорбцию разбавленного образца при 540 нм сравнивают с поглощением на той же длине волны стандартного раствора HiCN, эквивалентная концентрация гемоглобина.

Большинство производных гемоглобина (оксигемоглобин, метгемоглобин и карбоксигемоглобин, но не сульфгемоглобин) превращаются в HiCN и поэтому измеряются этим методом.

Ручной метод.

25 мкл крови добавляют к 5,0 мл реагента, перемешивают и оставляют на 3 минуты. Абсорбирование считывают при 540 нм против заготовки реагента. Точно так же измеряется поглощение стандарта HiCN.

Стандарт ICSH HiCN.

Основным преимуществом этого метода является то, что существует стандартное решение HiCN, произведенное и назначенное значение концентрации в соответствии с очень точными критериями, установленными и периодически пересматриваемыми Международным советом по стандартизации в области гематологии (ICSH).

Это международное стандартное решение является основным калибратором для коммерческих стандартных решений, используемых в клинических лабораториях по всему миру. Таким образом, все те, кто использует стандартизацию HiCN, эффективно используют один и тот же стандарт, значение которого было скрупулезно проверено.

Интерференция.

Мутность из-за белков, липидов и клеточного вещества является потенциальной проблемой со спектрофотометрической оценкой любого компонента крови, включая гемоглобин.

Большое разведение (1: 251) образца в значительной степени устраняет проблему, но ложно поднятые результаты c tHb могут возникать у пациентов с высокой концентрацией белка в плазме.

Выраженные липемические образцы и те, которые содержат очень большое количество белых клеток (лейкоцитов), также могут артефактивно повышать анализ c tHb аналогичным механизмом.

Преимущества метода HiCN.

  1. Международный стандарт — точный.
  2. Легко адаптируется к автоматизированным гематологическим анализаторам; таким образом, воспроизводимый (низкий SD и CV — внутри цикла CV обычно <0,5%).
  3. Хорошо разработан и тщательно исследован — рекомендуется ICSH.
  4. Недорогой реагент.

Недостатки HiCN.

  1. Ручной метод требует точного пипетирования и спектрофотометра.
  2. Реагент (цианид) — опасное вещество.

Вышеуказанное ограничивает его использование за пределами лаборатории.

От большого количества взвешенных липидов, белков плазмы и числа лейкоцитов — возможны ошибки (ложные результаты).

Не дифференцирует производные гемоглобина, которые не обладают кислородонесущей способностью (MetHb, COHb, SHb). Таким образом, можно переоценить кислородную способность крови, если они присутствуют в аномальных (более чем следовых) количествах.

Альтернативные методы.

Способ лаурилсульфата натрия.

Лаурилсульфат натрия (SLS) представляет собой поверхностно-активное вещество, которое лизирует эритроциты и быстро образует комплекс с высвобожденным гемоглобином. Продукт SLS-MetHb стабилен в течение нескольких часов и имеет характерный спектр с максимальной поглощающей способностью при 539 нм.

Комплекс подчиняется закону Бир-Ламберта, поэтому существует точная линейная корреляция между концентрацией Hb и поглощением SLS-MetHb.

Метод просто включает смешивание 25 мкл крови с 5,0 мл 2,08-ммоль/л раствора SLS (забуференного до рН 7,2) и считывания поглощения при 539 нм. Показано, что результаты c tHb методом SLS-Hb очень тесно коррелируют (r=0,998) с эталонным методом HiCN.

Этот метод был адаптирован для автоматизированных гематологических анализаторов и является столь же надежным с точки зрения точности и точности, как и автоматизированные методы HiCN. Основным преимуществом является то, что реагент нетоксичен. Он также менее подвержен ложному вмешательству липемии и повышенной концентрацией лейкоцитов.

Долгосрочная нестабильность SDS-MetHb исключает его использование в качестве стандарта, поэтому метод должен быть откалиброван с помощью крови, c tHb которой определяется с использованием эталонного метода HiCN.

Азид-метгемоглобин.

Этот метод основан на превращении гемоглобина в стабильный окрашенный продукт — азид-метгемоглобин, который имеет почти идентичный спектр поглощения по сравнению с HiCN.

Реагент, используемый в этом методе, очень похож на тот, который используется в эталонном методе HiCN с замещением азида натрия для более токсичного цианистого калия. Как и в методе HiCN, гемоглобин превращается в метгемоглобин феррицианидом калия; азид затем образует комплекс с метгемоглобином.

Результаты ctHb по этому методу сопоставимы с результатами, полученными с помощью эталонного метода HiCN; это приемлемый альтернативный ручной метод. Однако взрывной потенциал азида натрия препятствует его использованию на автоматизированных гематологических анализаторах. Реакция азида-MetHb была адаптирована для гемоглобинометров POCT.

Измерение с tHb вне лаборатории.

Рассматриваемые здесь методы POCT:

  1. Портативные гемоглобинометры.
  2. CO-оксиметрия — метод, используемый в анализаторах газов крови POCT.
  3. Цветовая шкала ВОЗ.

Гемоглобин методы измерения

Портативные гемоглобинометры.

Портативные гемоглобинометры, такие как HemoCue-B, позволяют точно определять гемоглобин у постели больного. Они представляют собой, по существу, фотометры, которые позволяют измерять интенсивность цвета растворов.

Микрокапля крови, в которой эти измерения сделаны, также действует как реакционный сосуд. Реагенты, необходимые как для высвобождения Hb из эритроцитов, так и для превращения Hb в стабильный окрашенный продукт, присутствуют в высушенной форме на стенках кюветы.

Все, что требуется, — это введение небольшого образца (обычно 10 мкл) капиллярной, венозной или артериальной крови в микропробирку и установки ее в прибор.

Прибор изготовлен на заводе-изготовителе с использованием стандарта HiCN, а поглощение тестового решения автоматически преобразуется в c tHb. Результат отображается менее чем за минуту.

Преимущества современных гемоглобинометров включают:

  1. Портативность.
  2. Аккумулятор или электропитание можно использовать в любом месте.
  3. Небольшой объем образца (10 мкл), полученный с помощью прокола пальца.
  4. Быстрота (результат за 60 секунд).
  5. Простота использования — без пипетирования.
  6. Минимальная подготовка, требуемая к «нелабораторному» персоналу.
  7. Стандартизован с HiCN — результаты, сопоставимые с результатами, полученными в лаборатории.
  8. Коррекция мутности. В этом отношении переносные гемоглобинометры превосходят большинство методов ctHb.

Эта технология была широко оценена в различных условиях, и большинство исследований подтвердили приемлемую точность по сравнению с лабораторными методами.

Недостатки.

Однако некоторые исследования вызвали обеспокоенность в связи с тем, что в результате отсутствия лабораторных результатов персонал может быть менее удовлетворительным. Несмотря на простоту эксплуатации, эти инструменты не защищены от ошибок оператора, а эффективное обучение, все-таки имеет важное значение.

Имеются данные, свидетельствующие о том, что результаты, полученные из образцов капилляров (пальцев), менее точны, чем результаты, полученные из хорошо перемешанных капиллярных или венозных образцов, собранных в пробирки.

Метод СО-оксиметрии.

CO-оксиметр представляет собой специализированный спектрофотометр, название которого отражает исходное приложение, которое должно было измерять COHb и MetHb.

Многие современные анализаторы газов крови имеют встроенный CO-оксиметр, позволяющий одновременную оценку c tHb при анализе газового состава.

Измерение c tHb с помощью CO-оксиметрии основано на том, что гемоглобин и все его производные являются цветными белками, которые поглощают свет на определенных длинах волн и, следовательно, имеют характерный спектр поглощения.

Закон Пира-Ламберта диктует, что поглощение одного соединения пропорционально концентрации этого соединения. Если известна спектральная характеристика каждого поглощающего вещества в растворе, то для расчета концентрации каждого такого вещества можно использовать показания поглощения раствора на нескольких длинах волн.

В измерениях поглощения CO-оксиметром образца гемолизированной крови на нескольких длинах волн в диапазоне, который поглощают свет гемоглобина (520-620 нм), используется установленным программным обеспечением для расчета концентрации каждого из производных гемоглобина (HHb, O 2 Hb, MetHb и COHb), c tHb — расчетная сумма этих производных.

Все, что требуется от оператора, — это инъекция хорошо смешанного образца венозной крови в газоанализатор крови или СО-оксиметр.

Образец или его часть автоматически накачивается в измерительную кювету СО-оксиметра, где — посредством химического или физического воздействия — эритроциты лизируются для высвобождения гемоглобина, который спектроскопически сканируется, как описано выше.

Результаты отображаются вместе с результатами анализа крови в течение минуты или двух.

Несколько исследований подтвердили, что результаты ctHb, полученные с помощью CO-оксиметрии, клинически значительно не отличаются от результатов, полученных из эталонных лабораторных методов. CO-оксиметрия обеспечивает приемлемый способ срочной оценки ctHb в условиях неотложной помощи.

Конкретные преимущества ctHb путем CO-оксиметрии включают:

  1. Скорость анализа.
  2. Простота анализа.
  3. Небольшой объем забора крови.
  4. Невысокая стоимость затрат.
  5. Дополнительные измеренные параметры: (MetHb, COHb, O 2 Hb).
  6. На качество анализа не влияет высокое количество белых клеток в образце крови.

Цветовая шкала гемоглобина ВОЗ (HCS).

Разработанный для Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) этот низкотехнологичный тест имеет ограниченное применение в развитых странах, но имеет огромное значение для экономически неблагополучных стран развивающегося мира, где наиболее распространена анемия.

В районах, где нет лабораторных установок и недостаточных ресурсов для финансирования более сложных гемоглобинометров POCT, это практически единственный способ определения c tHb.

Тест HCS основан на простом принципе, согласно которому цвет крови является функцией c tHb. Капля крови поглощается на бумаге и ее цвет по сравнению с графикой из шести оттенков красного, каждый оттенок представляет собой эквивалент c tHb: самые светлые 40 г/л и самые темные 140 г/л. Хотя в принципе очень просто, в разработке были использованы значительные исследования и технологии для обеспечения максимально возможной точности.

Например, обширные исследования различных документов информировали окончательный выбор бумаги для матрицы тест-полосок, а спектрофотометрический анализ смесей крови и красителей использовался для достижения максимально возможного соответствия между цветом диаграммы и цветом крови при каждом исследовании c tHb.

Преимущества теста HCS.

  1. Прост в использовании — требуется только 30 минут обучения.
  2. Быстро — результат в течение 1 минуты.
  3. Требуется только капля капиллярной крови.
  4. Очень дешев (около 0,12 доллара США за тест).

Недостатки теста HCS.

Надежные результаты зависят от строгого соблюдения инструкций по проведению исследования.

Общие ошибки включают:

  1. Неадекватная или чрезмерная кровь на тест-полоске.
  2. Чтение результатов слишком поздно (за 2 минуты) или слишком рано (менее 30 секунд).
  3. Чтение результата при плохом освещении.

Тест HSC явно имеет присущие ему ограничения. В лучшем случае он может определить, что ctHb образца пациента находится в одном из шести диапазонов концентрации: 30-50 г/л, 50-70 г/л, 70-90 г/л, 90-110 г/л, 110-130 г/л или 130-150 г/л. Тем не менее этого теоретически достаточно, чтобы идентифицировать количество гемоглобина у всех пациентов и дать указание на серьезность состояния у них.

Раннее исследование продемонстрировало способность испытуемого идентифицировать анемию (определяемую как ctHb <100 г/л) в 1213 образцах с чувствительностью 91% и специфичностью 86%. Последующие исследования подтвердили, что это приемлемый клинический инструмент для выявления анемии в отсутствие более сложных технологий и значительно более чувствителен и более специфичен, чем клинический осмотр.

Резюме.

c tHb является одним из двух параметров, обычно используемых для оценки кислородной способности крови и тем самым установления диагноза анемии и полицитемии.

Разработаны многочисленные методы, большинство из которых основано на измерении цвета гемоглобина. Методы, выбранные для обсуждения в этой статье, относятся к числу наиболее часто используемых сегодня.

При проведении отбора методов была предпринята попытка передать спектр технологий, которые в настоящее время используются, и как они применяются для удовлетворения клинического спроса на c tHb в условиях, которые варьируются от беднейших районов развивающегося мира, где медицинская помощь едва ли имеет плацдарм, до высокотехнологичного мира современного отделения интенсивной терапии.

Андрей Вязченко
Андрей Вязченко

Являюсь кандидатом медицинский наук, доцентом кафедры факультетской терапии. Опубликовал десятки научных и методических работ, учебных пособий. Принимаю участие в освоение новых методов лечения в области терапии.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *